Медуллобластома (МБ) является наиболее распространенной злокачествен-ной опухолью головного мозга у детей [1]. МБ развивается из гранулярных нейрональных


Чтобы посмотреть этот PDF файл с форматированием и разметкой, скачайте его и откройте на своем компьютере.
УЧЕНЫЕ ЗАПИСКИ КАЗАНСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
.

СЕРИЯ

ЕСТЕСТВЕННЫЕ НАУКИ

201
7
,
Т
.

15
9
,
кн
.

4



ISSN
2542
-
064X
(Print)




С
.
550

563


ISSN 2500
-
21
8
X

(Online)

550

УДК 577.29

АТОРВАСТАТИН БЛОКИРУЕТ РОСТ МЕДУЛЛОБЛАСТОМЫ
ТИПА SONIC HEDGEHOG
ПУТЕМ

АПОПТОЗ
А

Р.Э. Гордон
1,2
,

З.И. Абрамова
1

1
Казанский
(
Приволжский
)
федеральный университет
,
г. Казань
,
420008
,
Ро
с
сия

2
Онколог
и
ческий центр Фокс Чейз
,
г. Филадельфия
,
19111
,

США

Аннотация

Чрезмерная активация сигнального каскада Sonic
Hedgehog
является причиной ра
з-
вития медуллобластомы


наиболее распространенной злокачественной опухоли голо
в-
ного мозга у детей. Ранее нами было показано, что эндогенный холестерин выст
у
пает
непосре
дственным активатором каскада Sonic
Hedgehog
и является перспективной м
и-
шенью для таргетной терапии медуллобластомы. В
настояще
м
исследовании
гистохим
и-
ческий
анализ эффекта аторвастатина, широко применяемого в клинической практике
ингибитора биосинтеза хол
естерина, выявил высокий уровень кл
е
точной гибели в ткани
опухоли путём апоптоза. Полученные данные указывают на перспективу испол
ь
зования
статинов для терапии медуллобластомы, а также других злокачественных новообразов
а-
ний, в основе онкогенеза которых леж
ит активация си
г
нального пути Sonic
Hedgehog
.

Ключевые

слова
:

медуллобластома, Sonic
Hedgehog
, статины, аторвастатин, х
о-
ле
стерин, апоптоз


Введение

Медуллобластома (МБ) является наиболее распространенной злокачестве
н-
ной

опухолью головного мозга у детей
[1]
. МБ развивается из гранулярных
нейрональных клеток
-
предшественников на поверхности мозжечка, редко м
о-
жет метастазировать в другие отделы центральной нервной систе
мы (ЦНС)
с

потоком цереброспинальной жидкости
[2]
.
Традиционные методы лечения
в

клинической практике включают в себя хирургическое удаление опухоли,
химио
-

и лучевую терапии
[3]
. Несмотря на прогресс в нашем понимании онк
о-
генеза MБ, а также успехи стандартной тера
пии, значительная часть пац
и
ентов
имеет выживаемость не более 5 лет. Кроме того, пациенты страдают от множ
е-
ства серьезных побочных эффектов терапии, включающих когнитивные нар
у-
шения и эндокринные расстройства
[4]
.
Таким образом, менее токсичные и б
о-
лее эффективные подходы к лечению МБ являются ключевым напра
в
лением
исследований в данной области.

Одним из наиболее привлекательных подходов к терапии раковых забол
е-
ваний является индукция апоптоза


программируемой кле
точной гибели


в

опухолевых клетках. Данный подход позволяет направленно элиминировать
онкотрансформированные клетки, не
повреждая

здоровые ткани организма,
АТОРВАСТАТИН БЛОКИРУЕТ РОСТ МЕДУЛЛОБЛАСТОМЫ…


551

и

особенно актуален для терапии МБ у детей, поскольку гибель здоровых кл
е-
ток в развивающемся орган
изме приводит к серьезным нарушениям развития.

На основании молекулярно
-
генетических характеристик МБ классифицир
о-
ваны на
четыре

группы: WNT, Sonic Hedgehog,
г
руппа 3 и
г
руппа 4
[5]
.
Извес
т
но,
что группа Sonic Hedgehog (Shh), поражающая треть пациентов с МБ, характ
е-
ризуется агрессивным течением заболевания и плохим прогнозом выживаем
о-
сти и

наблюдается

главным образом у младенцев и детей до 14 лет
[6]
.

Сигнальный каскад Shh играет важную роль в ходе эмбриогенеза, а также
является ключевым путем, обеспечивающим развитие и функционирование г
о-
ловного мозга
[7]
.
В отсутствие лиганда Shh, антагонизирующий рецептор
Patched1 (Ptch1)
,

подавляет активность 7
-
трансмембранного G
-
белка Smoothened
(Smo), тем

самым блокируя передачу сигнала в каскаде (
рис
.

1). Ковалентное
взаимодействие между лигандом Shh и его рецептором P
tch1 уменьшает инг
и-
бирование Smo, в результате чего происходит запуск каскада событий, кул
ь-
минацией которых является активация транскрипционных фа
к
торов Gli1 и Gli2
(глиома
-
ассоциированных онкопротеинов 1 и 2)
[8]
.

Gli
-
белки транслоцирую
т
ся
в ядро клетки,
где они способствуют

транскрипции генов
Ptch1

и
Gli1
, явля
ю-
щихся ключевыми регуляторами пролифер
ации и дифференцировки клеток
в

ходе эмбрионального развития организма, а также в ходе онкогенеза
[9]
.
Нарушения в

передаче сигнала Shh в клетке могут привести к врожденным д
е-
фектам, в то
время как чрезмерная активность каскада Shh является причиной
развития онк
о
логических заболеваний человека, из числа которых МБ является
наиболее агрессивным недугом
[10]
. Поскольку рецептор Ptch1 является обра
т-
ным регул
я
тором каскада Shh, уд
аление данного белка из клетки путем генно
-
инженерных

манипуляций приведет к непрерывной активаци
и Shh
-
пути и, как
следствие, к

развитию МБ.



Рис. 1. Схема передачи сигнала
Shh в клетке


Холестерин является основным структурным компонентом клеточных ме
м-
б
ран, а также выполняет роль сигнальной молекулы в клетке
[11]
.
Извес
т
но, что
холестерин играет ключевую роль в передаче сигнала Shh
[12]
. Так, молекула х
о-
лестерина, ковалентно связанная с предшественником Shh, обеспечивает секр
е-
цию липофильного лиганда Shh во внеклеточное пространство
[13]
.
Недавние и
с-
следования, посвященные механизму регуляции онкопротеина Smo рецепт
о
ром
Ptch1, выявили, что молекула холестерина через ковалентное взаимоде
й
ствие
с

Smo приводит к конформационным изменениям онкопротеина и
,

как сле
д-
ствие, активирует Shh
-
путь при
интактном рецепторе Ptch1
[14

16]
.

Р.Э. ГОРДОН
,
З.И. АБРАМОВА


552

В головном мозге потребность в холестерине особенно высока,
так как
данная молекула является основным структурным компонентом миелин
о
вых
оболочек
[17]
.
Поскольку гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) предотвр
а
щает
проникновение холестерина и липопротеинов из кровотока позвоночных в г
о-
ловной мозг, потребность в холестерине обеспечивается за счет его би
о
синтеза
de novo

[18]
.
Биосинтез холестерина начинается с синтеза аце
тоацетил
-
КоА
из

двух молекул ацетил
-
КоА в цитозоле. Реакция образования мевалоната, к
а-
тализируемая ферментом гидроксиметилглутарил
-
КоА
-
редуктазой (ГМГ
-
КоА
-
редуктазой), проходит в эндоплазматическом ретикулуме и

является лимит
и-
рующей стадией биосинтеза холестерина. Фермент ГМГ
-
КоА
-
редуктаза явл
я-
ется мишенью статинов


широко применяемых в клинической практике инг
и-
биторов биосинтеза холестерина
[19]
. Статины являются привлекательн
ы
ми
гиполипидемическими препаратами ввиду высокой эффективности, низкой
токсичности и доступности.
Побочные
продукты реакции превращен
ия мев
а-
лоната быстро метаболизируются в клетке,
поэтому

побочные эффекты стат
и-
нов остаются минимальными
[20]
.

Ранее несколькими исследовательскими группами было показано, что ст
а-
тины ингибируют рост, а также оказы
вают апоптотический эффект на клетки
МБ
[21

23]
. Следует отметить, что данны
е исследования были проведены
в

клеточных линиях, в которых, как было показано позднее
[24]
, акт
ивность
сигнального каскада Shh в условиях
in vitro

не сохраняется. Несмотря на то что
подавляющий эффект статинов на рост клеток МБ был отмечен несколькими
исследователями, апоптотический эффект статинов в вивальных моделях МБ
ранее описан не был. В
насто
ящей

работе нами был
о

оценен
о

влияние

статина
тр
е
тьего поколения аторвастатина на рост, пролиферацию и апоптоз клеток и
тк
а
ней МБ, полученных из мышей, нокаутных по гену
Ptch1
. Было обнаруже
но,
что аторвастатин оказывает ингибирующий эффект на рост и проли
ферацию
пе
р
вичной культуры МБ типа Shh. В экспериментах
in vivo

было показано, что
снижение роста подкожного аллотрансплантанта МБ связано с увеличен
и
ем
уровня апоптоза в тканях МБ. Таким образом, аторвастатин может быть и
с-
пользован для подавления роста МБ
.

1. Материалы и методы

1.1.

Получение первичной культуры клеток медуллобластомы методом
сепарации в перколле
.
Для исследований были использованы
Ptch1
-
нокаутные
мыши. Все эксперименты проводили в соответствии с протоколом, одобре
н
ным
Комитетом по содержан
ию и использованию лабораторных животных (IACUC)
в Онкологическом центре Фокс Чейз (г. Филадел
ь
фия, США).

Первичные клетки МБ выделяли по ранее описанной методике
[2]

из оп
у-
холей
Ptch1
-
нокаутных

мышиных
МБ. Мышь, и
меющая опухоль в мозжечке,
подвергалась эвтаназии в СО
2
-
камере (Airgas, США). С

использованием хиру
р-
гических инструментов головной мозг извлекался из черепа в стерильных
условиях. Мозжечок, отделенный от большого мозга, и
з
мельчали скальпелем и
инкубировали

в растворе ФСБ с 10

МЕ
/мл
папаина (Worthington, США),
200

мг/мл L
-
цистеина (Sigma
-
Aldrich, США) и

250

МЕ/мл
ДНКазы I (Sigma
-
Aldrich, США) в течение 30

мин при 37

°С. По

окончании инкубации остатки
АТОРВАСТАТИН БЛОКИРУЕТ РОСТ МЕДУЛЛОБЛАСТОМЫ…


553

ткани измельчалась пипетированием до гомогенной клеточной
суспензии в ра
с-
творе ФСБ (Life Technologies, США) с содержанием 5

мг/мл ингибитора три
п-
сина (Gibco, США) и 250 МЕ/мл ДНКазы I
(Sigma
-
Aldrich, США). Для получ
е-
ния чистой популяции клеток МБ получен
ная клеточная суспензия была це
н-
трифугирована в градиенте 35
% и 65% перколла (GE Health, США) при це
н-
тробежном ускорении 800

g в течени
е

12 м
и
н
.

Интерфазу, содержащую

клетки МБ, отмывали в растворе ФСБ с послед
у-
ющим центрифугированием 300

g в течение 10 мин. Полученная клеточная п
о-
пуляция была собрана для дальнейше
й оценки жизн
е
способности и подсчета
клеток в камере Горяева методом исключения трипанового синего. Получе
н-
ные клетки сажали на покровное стекло (Fisher Scientific, США), предвар
и-
тельно инкубированное в растворе 0.1

мг/мл поли
-
D
-
лизина (Mw



300

к
Да)
(Mill
ipore, США), и культивировали в питательной среде для нейронов (Gibco,
США), содержащей 2% нейрональной добавки В
-
27 (Gibco, США), 1

ммоль

п
и
рувата Na, 1% L
-
глутамина, 1%

пенициллина и стрептомицина в атмосфере
5%
-
ного

СО
2

при 37

°С. Аторвастатин (Cay
man C
hemicals, США) разводили
в

ДМСО. Методом серийных разведений готовили конечную смесь питател
ь-
ной среды с аторвастатином, которую инкубировали с клетками МБ в течение
48

ч в атм
о
сфере 5%
-
ного

СО
2

при 37

°С.

По истечении инкубации образцы клеток МБ фиксиров
али в 4%
-
ном

ра
с-
творе параформальдегида (ПФА) на ФСБ в течение 15 мин для дальнейшего

и
м-
мунофлуоресцентного анализа.


1.2.

Подкожная трансплантация клеток медуллобластомы иммуноко
м-
петентным

мышам
.
Первичные клетки МБ выделяли из мозжечка
Ptch1
-
но
-
каутных

м
ышей. Полученные клетки суспе
ндировали в растворе Matrigel с

п
о-
ниженным содержанием ростовых факторов и вводили 2
·
10
6
/100

мкл по
д
кожно
мышам линии CB57/SCID. Администрирование аторвастатина в раств
о
ре ФСБ
осуществляли методом
per os
.


1.3.

Приготовление за
мороженных срезов ткани медуллобластомы
.
Для
приготовления замороженных образцов ткань аллотрансплантанта МБ, извл
е-
ченную хирургическим путем из
-
под кожи мыши, фиксировали в 4%
-
ном

ра
с-
творе ПФА в течение 12 ч, после чего помещали ткань в раствор 30%
-
ной

са
х
а-
розы (Fisherbrand, США)

на дополнительные 12

ч для криопротекции, после чего
заливали образец раствором
Optimal

Cutting

Temperature

(
О
СТ
)
(Fish
erbrand,
США) и замораживали на

сухом льду. Полученный блок использовали для
приготовления замороженных срезов
толщиной 12 мкм на криост
а
те CM
-
3050
S (Leica, Германия) при температуре

20

°С
. Ткань высушивали на воздухе
и

хранили при темпера
т
у
ре

20

°С.


1.4. Иммунофлуоресцентный анализ
.
Иммунофлуоресцентный (ИФ) ан
а-
лиз проводили в соответствии со ста
н
дартными про
токолами производителей
антител. В частности, клеточный монослой или ткань отмывали от остатков ра
с-
твора ПФА или ОСТ соотве
т
ственно в растворе ФСБ
-
Т (20%
-
ный

Тритон Х
-
100)

(Fisherbrand, США), после чего блокировали в 10%
-
ном

растворе но
р
мальной
козьей сыво
ротки (Cell Signaling, США) на ФСБ в течение 1

ч при комнатной
Р.Э. ГОРДОН
,
З.И. АБРАМОВА


554

температуре. Ткань инкубировали с раствором первичных антител (концентр
а-
ции антител в 10%
-
ном

растворе нормальной козьей сыворотки на ФСБ:
бро
м-
дезоксиуридин

(БрдУ) 1:200; ка
с
паза
-
3 1:500) в теч
ение 12

16

ч при 4

°
С. Ткань
отмывали от первичных антител в растворе ФСБ
-
Т 3 раза по 10 мин. Инкуб
а
цию
со вторичными антителами и ДАФИ (Roche, Швейцария) в 10%
-
ном

ра
с
творе
нормальной козьей сыворотки на ФСБ проводили при комнатной темп
е
ратуре
в

течение 2

ч в темноте. Ткань отмывали от вторичных антител в растворе
ФСБ
-
Т

3

раза по 10

мин. Готовые ИФ
-
срезы заливали раствором Fluoromount
-
G
(Fisherbrand, США) и накрывали покровным стеклом для долгосрочного хран
е
ния.

ИФ
-
анализ проводили с использованием светов
ой микроскопии на микр
о-
скопе Nikon Eclipse Ti (Nikon, Германия). Подсчет клеток осуществляли с и
с-
пользованием программы ImageJ.


1.5.

Вестерн
-
блот
.
Для оценки уровня экспрессии белков методом
в
е
стерн
-
блот были подготовлены клеточные лизаты. Клеточный монос
лой лиз
и
ровали
с

использованием буфера RIPA (Thermo Scientific, США) с добавлением инг
и-
биторов протеаз (Thermo Scientific, США) и фосфатаз (Roche, Шве
й
цария) при
4

°С. Лизат тщательно пипетировали и инкубировали на льду в течение 30

мин
для достижения полн
ого лизиса. Во избежание загрязн
ения образца клеточным
дебрисом

образцы центрифугировали при центробежном ускор
е
нии 15000

g
в

течение 15

мин при 4

°С. Полученный супернатант отбирали в чистую пр
о-
бирку и измеряли концентрацию белка с помощью набора Pierce B
CA Protein
Assay Kit (Thermo Scientific, США) в соответствии с прил
а
гаемой инструкцией.
Считывание данных проводили с помощью спектрофот
о
метра Nanodrop 2000
(Thermo Scientific, США). Полученные белковые лизаты денатурировали с д
о-
бавлением шестикратного буф
ера, содержащего 0.375

моль

Tris pH 6.8, 12%
додецилсульфата натрия, 60% глицерина, 0.6

моль

дитиотреитол, 0.06% крас
и-
теля бромфенолового синего при 100

°С в течение 10

мин.

Полиакриламидный гель (ПААГ) был приготовлен с использованием ра
с-
твора акриламид



бисакриламид 30:1 (Bio
-
Rad, США), 0.5

моль

и 1.5

моль

б
у-
феров
Трис
-
HCl рН 6.8 и 8.8 соответственно, ТЕМЕД (Bio
-
Rad, США),
дисти
л-
лирова
н
ной воды

и свеже
го раствора персульфата аммония (Bio
-
Rad, США).
Клеточные лизаты разго
няли в

вертикальном 10
%
-
ном

ПААГ,

в буфере, с
о-
держащем: 25

ммоль

Трис
-
HCl, 190

ммоль

глицина, 1% додецилсульфата
натрия (рН

8.3) при напряжении 80

120

В

в течение 2

ч. В качестве протеинов
о
го
стандарта использовали маркер WesternC (Bio
-
Rad, США). Перенос на PVDF
-
мембрану осуществляли в бу
фере, содержащем 25

ммоль

Трис
-
HCl, 190

ммоль

глицина, 20% мет
а
нола, рН

8.3 при 100

В

в течение 3

ч. Мембрану

блокировали
в растворе 0.5%
-
ного

обезжир
енного сухого молока на TBS
-
T в

течение 1

ч.
Инкубация с первичными антителами (1:1

000) в растворе 0.5%
-
н
ого

обезж
и-
ренного сухого молока на TBS
-
T
ос
у
ществлялась в течение 16

18

ч при 4

°С.
После инкубации с первичными антителами мембрану отмывали в растворе
TBS
-
T 3 раза по 10

мин, после чего инкуб
и
ровали со вторичными HRP
-
мечеными

антителами в течение 1

ч при

комнатной температуре. Мембрану от
мывал
и
в

растворе TBS
-
T 3 раза по 10

мин и инкубировали в растворе для проявления

а
н
тител, меченных перокси
дазой хрена SuperSignal West Pico Chemoluminescent
АТОРВАСТАТИН БЛОКИРУЕТ РОСТ МЕДУЛЛОБЛАСТОМЫ…


555

Substrate (Thermo Scientific, США). Хемилюменисценцию фиксирова
ли на ф
о-
топленке, которую проявляли с помощью проявителя (Abnova, США). Пол
у-
ченные фотопленки сканировали при помощи фотоск
а
нера (Canon, США).

2.
Результаты и их обсуждение

2.1.

Аторвастатин ингибирует пролиферацию клеток медуллобласт
о
мы

in vitro
.
Для того

чтобы оценить эффект аторвастатина на выживаемость клеток
МБ
in vitro
, первичную культуру клеток МБ, выделенную из мозжечка
Ptch1
-
нокаутных мышей по описанной ранее методике
[2]
, культивировали в свобо
д-
ной от холе
стерина питательной среде для нейронов с добавлением аторваст
а-
тина в концентрации 10

и 50

нмоль
. Раствор ДМСО был использован в ка
ч
е-
стве
контрольного варианта
. После 72
-
часов
ой

инкубации

в контрольном о
б-
разце был обнаружен плотный монослой клеток (
рис
.

2
,

а
), состоящий из дел
я-
щихся нейронов, в то время как в образцах, содержащих аторвастатин, наблюд
а-
лось дозоз
а
висимое снижение количества жизнеспособных клеток (
рис
.

2
,
б
,

в
).
В образце, содержащем 50

нмоль

аторвастатина, было отмечено увеличение
количества п
о
гибших клеток (рис.

2,
в
).



Рис.

2. Первичная культура клеток МБ мыши
после
72
-
ч
асовой

инкубации
:
а



ко
н-
троль
ный образец
(
ДМСО
)
,
б



аторвастатин (10 нмоль
),
в



аторвастатин (50
нмоль
)
(дозо
зависимое снижение количества жизнеспособных клеток, опред
еляется по пон
и-
женно
му колич
е
ству клеток в поле зрения микроскопа). Масштаб 10
мкм

Для определения причины снижения количества жизнеспособных клеток
был проведен анализ пролиферации в первичной культуре
Ptch1
-
нокаутных

кл
е-
ток МБ. Клетки МБ были мечены инте
ркалирующим агентом БрдУ, селе
к
тивно
проникающим в клетки, находящиеся в S
-
фазе митоза.
После 70
-
часовой
в
ы-
держки в культуральной среде

клетки МБ ин
кубировали в присутствии БрдУ
в

течение 2

ч, после чего фикси
ровали образцы и проводили ИФ
-
анализ эк
с-
прессии

БрдУ. Клеточные ядра б
ы
ли окрашены ДАФИ.

Как показано на
рис
.

3
,
а

и

4, контрольный образец содержал около 23%
активно делящихся клеток. Добавление аторвастатина в культуру прив
о
дило
к

снижению количества БрдУ
-
положительных клеток, а также к снижению о
б-
щ
его количества жизнеспособных клеток (
рис
.

3
,
б
,
в
). Например, в образце,
содержащем 10
нмоль

аторвастатина, количество делящихся клеток сниж
а
лось
до 25%, в то время как в образце, содержащем 50
нмоль

аторвастатина, общее
кол
и
чество БрдУ
-
положительных клет
ок не превышало 5% (
рис
.

4).

а
)

б
)

в
)

Р.Э. ГОРДОН
,
З.И. АБРАМОВА


556


Рис.

3.
Оценка уровня пролиферации (БрдУ
-
положительные клетки) в первичной кул
ь
туре
клеток МБ мыши
после 72
-
часовой инкубации

с помощью
ИФ
-
анализ
а
:
а



ко
н
трольный
образец
(ДМСО)
,
б



аторв
а
статин 10
нмоль
,
в



аторвастат
ин 50
нмоль
. Масштаб 10
мкм


Рис.

4.
Количественный анализ пролиферации (БрдУ
-
положительные клетки, %) в пе
р-
вичной культуре клеток МБ мыши после
72
-
часовой инкубации
. *



p



0.05,
**


p



0.005

Ранее в литературе

21

23


сообщалось о подавляющем эффекте

статинов
на пролиферацию клеток МБ
in vitro
,
однако авторами были использованы в
ы-
сокие концентрации статинов (5

10

мкмоль
), которые приводили к неспец
и-
фичному, токсичному эффекту, вызывающему гибель клеток МБ. В экспер
и-
ментах,
проведенных нами, были испол
ьзованы концентрации статина на пор
я-
док н
и
же, чем в ранее опубликованных исследованиях. Следует отметить, что
около 5%
клеток продолжали делиться, что указывает на то, что нами были и
с-
пользов
а
ны физиологически допустимые концентрации аторвастатина.

В ранее

описанных в литературе исследованиях было показано, что пе
р-
вичная культура клеток
Ptch1
+/−
p53
−/−

МБ характеризуется высоким уровнем
экспрессии транскрипционного фактора Gli1, являющегося ключевым марк
е-
ром активации сигнального каскада Shh. Интересно, что
высокая экспрессия
Gli1 не наблюдалась в тех первичных образ
цах МБ, которые были помещены
в

культуру
in vitrо
[24]
.
Для того чтобы проверить, применим ли данный фен
о-
мен к нашей системе, нами был проведен следующий
эксперимент. Первичные
клетки

МБ


из

Ptch1
-
нокаутных


мышей


были

помещены


в

культуру

кл
е
ток.

а
)

б
)

в
)

АТОРВАСТАТИН БЛОКИРУЕТ РОСТ МЕДУЛЛОБЛАСТОМЫ…


557


Рис. 5. Анализ экспрессии белка Gli1 в первичной культуре
клеток
Ptch1
+/


МБ методом
вестерн
-
блот. Анализ экспрессии белка GAPDH использован в качестве
к
о
н
трольного
варианта

После 72
-
и 96
-
часовой инкубации клетки МБ были использованы для приг
о-
товл
е
ния клеточных лизатов и дальнейшего анализа экспрессии Gli1 методом
вестерн
-
блот. В

качестве контроля нами были использованы свежепригото
в-
ленные клетки МБ, котор
ые не были помещены в культуру клеток.

Как показано на рис.

5, свежеприготовленные клетки МБ, как и ожид
а
лось,
характеризовались высокой экспрессией белка Gli1. Однако образец клеток
МБ, культивированный в течение 72

ч, характеризовался пониженной экспре
с-
с
ией белка Gli1. К 96
-
му часу
инкубации

экспрессии Gli1 в образце клеток МБ
обнаружено не было. Полученные данные указывают на то, что сигнальный ка
с-
кад Shh ослабевает в культуре клеток, в то время как его активность в о
б
разцах
in vivo
сохр
аняется. Таким образом, использование моделей культуры МБ
in vitrо
обо
с
нованно лишь в пределах 72

ч в культуре с обязательным использованием
соо
т
ветствующих контрол
ьных образцов
. Эти данные также свидетельству
ют
о

важности верификации полученных на моделях

in vitrо
данных в системе
in vivo.


2.2.

Аторвастатин вызывает апоптоз в клетках медуллобластомы
in vivo
.

Для того чтобы оценить эффект статинов на рост опухолей МБ
in vivo
, нами
были использованы подкожные аллотрансплантанты МБ
Ptch1
-
нокаутных м
ы-
шей
. Пол
ученные в результате трансплантации опухоли МБ подверглись леч
е-
нию аторвастатином в дозе 10 и 40 мг/кг/
сут

в течение 3 недель. По предвар
и-
тельным данным нами было обнаружено, что использование аторвастатина в
дозе 40 мг/кг/
сут

эффективно блокирует рост под
кожных аллотранспланта
н
тов
медуллобластом.

В настоящей работе нами был проведен ИФ
-
анализ экспрессии каспазы
-
3
как маркера апоптоза
[25]

в полученных тканях МБ.
Как показано на
рис
.

6
,
а
,

в

контрольной ткани к
оличество
апоптотических
каспаза
-
3
-
положительных кл
е-
ток минимально и равно приблизительно 1% (
рис
.

7
). Было обнаружено,
что ат
о-
рвастатин в дозировке 10

мг/кг/
сут

приводит к увеличению количества
каспаза
-
3
-
положительных клеток до 2% (
рис
.

6
,
б

и
7
).
Доза ат
орвастатина 40

мг/кг/
сут

привела к еще большему количеству апоптотических клеток, достигнув показ
а-
теля 4% (
рис
.

6
,
в

и
7
)
.

Полученные данные свидетельствуют о том, что аторвастатин подавляет
выживаемость, пролиферацию и рост МБ, что обусловлено повышением
пок
а-
зателя программируемой клеточной гибели. Описанные нами данные указыв
а
ют
на то, что статины, в частности аторвастатин, могут быть использованы для
подавления пролиферации и роста клеток МБ типа
Shh
.

Р.Э. ГОРДОН
,
З.И. АБРАМОВА


558


Рис.

6
.
ИФ
-
анализ
уровня

апоптоза (каспаза
-
3
-
пол
ожительные клетки) в ткани
Ptch1
+/


МБ
мыши после 3 недель администрирования аторвастатина:
а



контрольный образец

(ДМСО)
,
б



аторвастатин 10 мг/кг/
сут
,
в



аторвастатин 40 мг/кг/
сут
. Масштаб 10

мкм


Рис.

7
. Количественный анализ уровня апоптоза (каспаз
а
-
3
-
положительные
клетки, %)
в

тканях аллотрансплантанта МБ мыши после 3 недель лечения аторвастатином.
*


p



0.05, нз


p



0.0
5

Заключение

Дисрегуляция сигнального каскада Shh является ведущей причиной онког
е-
неза медуллобластомы, базальной клеточной ка
рциномы, рамбдомиосарк
о
мы,
а

также сопряжена с патогенезом многих других солидных опухолей
[27]
,
п
о-
этому

Shh
-
путь продолжает оставаться привлекательной мишенью для тарге
т-
ной терапии ряда онкологических заболеваний. К настоящему времени были
разработаны и о
добрены для применения в клинической практике два анал
о-
гичных селекти
в
ных ингибитора онкопотеина Smo


висмодегиб и сонидегиб.
Однако висмодегиб высоко токсичен, он вызывает нарушения развития кос
т-
ной ткани у м
о
лодых мышей
28, поэтому данный препарат не
был одобрен
для лечения
м
е
дуллобластомы

у детей.


В отличие от ингибиторов Smo, статины широко применяются для терапии
некоторых детских заболеваний, например при дислипидимии
[29].

Учитывая
это
,

следует подчеркнуть, что проведенные нами исследования выяви
ли ва
ж
ное
а
)

б
)

в
)

АТОРВАСТАТИН БЛОКИРУЕТ РОСТ МЕДУЛЛОБЛАСТОМЫ…


559

свойство статинов, в частности, нами показано, что подавление биосинтеза хол
е-
стерина приводит к снижению пролиферации и усилению апоптоза в кле
т
ках МБ
типа Shh на моделях
in vitrо
и
in vivo
,
подчеркивая особую роль холестер
и
на
в

онкогенезе
медулл
областомы
.

Поскольку

статины хорошо изучены

и

обладают низкой токсичностью и
минимальными побочными эффектами, применение данной группы лека
р-
ственных препаратов представляет многообещающий подход для лечения
м
е-
дулло
б
ластомы типа Shh, а также других новооб
разований, ассоциирован
ных
с

пов
ы
шенной активацией каскада Shh.


Благодарности.

Работа выполнена при поддержк
е

Программы Правител
ь-
ства Российской федерации повышения конкурентоспособности Казанского ф
е-
дерального ун
и
верситета.

Литература

1.

Klesse L.J., Bowers D.C.

Childhood medulloblastoma: current status of biology and
treatment // CNS Drugs.


2010.


V.

24,
No

4.


P.

285

301.


doi: 10.2165/11530140
-
000000000
-
00000.

2.

Yang Z.J., Ellis T., Markant S.L., Read T.A., Kessler J.D., Bourboulas
M., Schuller U.,
Machold R., Fishell G., Rowitch D.H., Wainwright B.J., Wechsler
-
Reya R.J.
Medulloblastoma

-
restricted progenitors
or stem cells // Cancer Cell.


2008.


V.

14,
No

2.


P. 135

145.


doi:
10.1016/j.ccr.2008.07.003.

3.

Packer R.J., Zhou T., Holmes E., Vezina G., Gajjar A.

Survival and secondary tumors in
children with medulloblastoma receiving radiotherapy and adjuvant chemotherapy:
Results of Children

s Oncology Group trial A9961 // Neuro Onco
l.


2013.

V.

15,
No

1.



P. 97

103.


doi: 10.1093/neuonc/nos267.

4.

Roussel M.F., Robinson G.

Medulloblastoma: advances and challenges // F1000 Biol
Rep.


2011.


V. 3,

No

5.



P.

1

3.


doi: 10.3410/B3
-
5
.

5.

T
aylor M.D., Northcott P.A., Korshunov A., Remke
M., Cho Y.J., Clifford S.C., Eber
-
hart

C.G., Parsons D.W., Rutkowski S., Gajjar A., Ellison D.W., Lichter P., Gilbert
-
son

R.J., Pomeroy S.L., Kool M., Pfister S.M.

Molecular subgroups of medulloblastoma:
the current consensus // Acta Neuropathol.


2012.


V.

123,
No

4.


P.

465

472.


doi:
10.1007/s00401
-
011
-
0922
-
z.

6.

Gajjar A.J., Robinson G.W.
Medulloblastoma
-
translating discoveries from the bench
to

the bedside // Nat. Rev. Clin. Oncol.


2014.


V.

11,
No

12.


P.

714

722.


doi:
10.1038/nrclinonc.2014.18
1.

7.

Marti E., Bovolenta P.

Sonic hedgehog in CNS development: one signal, multiple outputs //
Trends Neurosci.


2002.


V.

25,
No

2.


P.

89

96.

8.

Hui C.C., Angers S.

Gli proteins in development and disease // Annu. Rev. Cell Dev.
Biol.


2011.


V.

27.


P.

513

537.


doi: 10.1146/annurev
-
cellbio
-
092910
-
154048.

9.

Fuse N., Maiti T., Wang B., Porter J.A., Hall T.M., Leahy D.J., Beachy P.A.

Sonic
hedgehog protein signals not as a hydrolytic enzyme but as an apparent ligand for patched //
Proc. Natl. Acad. Sci. U.

S. A.


1999.


V. 96,
No

20.


P.10992

10999.

10.

Ruiz i Altaba A., Sanchez P., Dahmane N.

Gli and hedgehog in cancer: tumours, embryos and
stem cells // Nat. Rev. Cancer.


2002.


V.

2,
No

5.


P.

361

372.


doi: 10.1038/nrc796.

11.

Orth M., Bellosta S.
Choles
terol: its regulation and role in central nervous system disorders //
Cholesterol.


2012.


V.

2012.


Art.

292598, P.

1

19.


doi:

10.1155/2012/292598
.

Р.Э. ГОРДОН
,
З.И. АБРАМОВА


560

12.

Riobo N.A.

Cholesterol and its derivatives in So
nic Hedgehog signaling and cancer // Curr.
Opin. Pharmacol.


2012.


V. 12,
No

6.


P.

736

741.


doi: 10.1016/j.coph.2012.07.002.

13.

Ryan K.E., Chiang C.
Hedgehog secretion and signal transduction in vertebrates // J. Biol.
Chem.


2012.


V.

287,
No

22.


P.

17905

17913.


doi: 10.1074/jbc.R112.356006.

14.

Mydock
-
McGrane L., Covey D.F., Rambo R.P., Sansom M.S.P, Newstead S., Rohatgi R.,
Siebold C.
Structural basis of Smoo
thened regulation by its extracellular domains //
Nature.


2016.


V.535,
No

7613.


P.

517

522.


doi: 10.1038/nature18934.

15.

Huang P., Nedelcu D., Watanabe M., Jao C., Kim Y., Liu J., Salic A.

Cellular cholesterol
directly activates Smoothened in Hedgehog

signaling // Cell.


2016.


V.

166,
No

5.


P.

1176

1187.


doi: 10.1016/j.cell.2016.08.003.

16.

Siebold C., Rohatgi R.

Cholesterol activates the G
-
protein coupled recepto
r Smoothened
to promote Hedgehog signaling //
eLife
.


2016.


V.

5.


Art.

e20304, P.

1

22.


doi:
10.7554/eLife.203
04
.

17.

Zhang J., Liu Q.



2015.


V.

6,

No

4.


P. 254

264.


doi: 10.1007/s13238
-
014
-
0131
-
3.

18.



2001.



V.

12,

No

2.


P.105

112.

19.

Goldstein J.L., Brown M.S.

Regulation of the mevalonate pathway // Nature.


1990.


V.

343,

No

6257.


P.425

430.


doi: 10.1038/343425a0.

20.

Collins R., Reith C., Emberson J., Armitage J., Baigent C., Blackwell L., Blumenthal R.
,
Danesh J., Smith G.D., DeMets D., Evans S., Law M., MacMahon S., Martin S., Neal B.,
Poulter N., Preiss D., Ridker P., Roberts I., Rodgers A., Sandercock P., Schulz K.,
Sever


nce


2016.


V.

388,
No

10059.


P.

2532

2561.


doi: 10.1016/S0140
-
6736(16)31357
-
5.

21.

Dimitroulakos J., Ye L.Y., Benzaquen M., Moore M.J., Kamel
-
Reid S., Freedman M.H.,
Yeger H., Penn L.Z.

Differenti
al sensitivity of various pediatric cancers and squamous
cell carcinomas to lovastatin
-
induced apoptosis: Therapeutic implications // Clin. Cancer
Res.


2001.


V.

7,
No

1.


P.

158

167.

22.

Macaulay R.J., Wang W., Dimitroulakos J., Becker L.E., Yeger H.
Lova
statin
-
induced
apoptosis of human medulloblastoma cell lines in vitro // J. Neurooncol.


1999.


V.

42,
No

1.


P.

1

11.

23.

Wang W., Macaulay R.J.
Mevalonate prevents lovastatin
-
induced apoptosis in medullo
-
blastoma cell lines // Can. J. Neurol. Sci.


1999.



V.

26,
No

4.


P.

305

310.

24.

Sasai K., Romer J.T., Lee Y., Finkelstein D., Fuller C., McKinnon P.J., Curran T.

Shh

pathway activity is down
-
regulated in cultured medulloblastoma cells: implications
for preclinical studies // Cancer Res.


2006.


V.

66,

No

8.


P.

4215

4222.


doi:
10.1158/0008
-
5472.CAN
-
05
-
4505.

25.

Gage G.J., Kipke D.R., Shain W.

Whole animal perfusion fixation for rodents // J.
Visualized Exp.


2012.


V.

65.


Art.

e3564, P.

1

9.


doi: 10.3791/3564
.

26.

Porter A.G., Janicke R.U.

Emerging rol
es of caspase
-
3 in apoptosis // Cell Death Differ.


1999.


V.

6, No

2.


P. 99

104.



doi: 10.1038/sj.cdd.4400476.


Поступила в редакцию

25
.0
7
.17



АТОРВАСТАТИН БЛОКИРУЕТ РОСТ МЕДУЛЛОБЛАСТОМЫ…


561

Гордон Рената Эмилевна,

аспирант кафедры биохимии и биотехнологии; аспирант

Казанский (Приволжский) федер
альный университет

ул. Кремлевская, д. 18, г. Казань, 420008, Россия

Онколог
и
ческий центр Фокс Чейз

Коттман авеню, 333
,

г. Филадельфия,
19111
, США

E
-
mail:
[email protected]

Абрамова Зинаида Ивановна
, доктор биологических наук, профессор кафедры био
химии и

би
о-
технологии

Казанский (Приволжский) федеральный университет

ул. Кремлевская, д. 18, г. Казань, 420008, Россия

E
-
mail:
[email protected]




















ISSN
2542
-
064X

(Print)


















ISSN 2500
-
218X (Online)

UCHENYE ZAPISKI KA

SERIYA ESTESTVENNYE NAUKI

(Proceedings of Kazan University. Natural Sciences Series)

201
7
, vol. 15
9
, no.
4
, pp.
550

563


Atorvastatin Blocks Sonic Hedgehog Medulloblastoma Progression

through Apoptosis

R.E. Gordon
a,b*
,
Z.I. Abramova
a
**

a
Kazan Federal University
,
Kazan
,
420008 Russia

b
Fox Chase Cancer Center
,
Philadelphia
,
19111 USA

E
-
mail:
*
[email protected]
,
**
[email protected]

Received July 25, 2017

Abstract

Aberrant activation of Sonic Hedgehog signaling transduction leads

to formation of numerous
malignancies, including medulloblastoma (MB)


the most common malignant pedia
t
ric tumor. Earlier,
we have shown that endogenous cholesterol acts as a direct activator of the So
n
ic Hedgehog signaling
and is a promising target fo
r treating MB. Histochemical analysis of the effect of atorvastatin, which is
widely used in clinical practice as a cholesterol biosynthesis inhibitor, revealed a high level of cell death
in the tumor tissue via apoptosis. These data show the potential of
using statins for the targeted therapy
of m
e
dulloblastoma, as well as other Sonic Hedgehog
-
driven malignancies.

Keywords:

medulloblastoma, Sonic Hedgehog, statins, atorvastatin, cholesterol, apoptosis

Acknowledgments
.
The study was supported by the Russian

Government Program of Competitive
Growth of Kazan Federal University.

Figure Captions

Fig.

1. The scheme of Shh signal transduction in the cell.

Fig.

2. The primary cell culture of mouse MB cells after 72
-
h incubation:
a



control sample (DMSO),
b



atorv
astatin (10 nmol),
c



atorvastatin (50 nmol). (dose
-
dependent decrease in the number of
viable cells, identified by the low number of cells per visual field). Scale: 10 µm.

Fig.

3. The assessment of the proliferation level (BrdU
-
positive cells) in the pri
mary mouse MB cell
culture after 72
-
h incubation using IF
-
analysis:
a



control sample (DMSO),
b



atorvastatin
(
10

nmol),
c



atorvastatin (50 nmol). Scale: 10 µm.

Fig.

4. The quantitative analysis of proliferation (BrdU
-
positive cells, %) in the primary
mouse MB cell
culture after 72
-
h incubation. *


p



0.05, **


p



0.005.

Fig.

5. The analysis of Gli1 protein expression in the primary culture of
Ptch1
+/


MB cell culture by
Western blotting
. GAPDH protein analysis was used as a control variant.

Р.Э. ГОРДОН
,
З.И. АБРАМОВА


562

Fig.

6.

The IF
-
analysis of apoptosis level (caspase3
-
positive cells) in the tissue of
Ptch1
+/


MB
mice
after three weeks of atorvastatin administration:
a



control sample (DMSO),
b



atorvastatin
(10

mg/kg/day),
c



atorvastatin (40 mg/kg/day). Scale: 10

µm.

Fig
.

7. The quantitative analysis of apoptosis level (caspase3
-
positive cells, %) in mouse MB allograft
ti
s
sues after three weeks of treatment with atorvastatin. *


p



0.05, ns


p



0.05.

References

1.

Klesse L.J., Bowers D.C. Childhood medulloblastoma: Cu
rrent status of biology and treatment.
CNS Drugs
, 2010, vol. 24, no. 4, pp 285

301. doi: 10.2165/11530140
-
000000000
-
00000.

2.

Yang Z.J., Ellis T., Markant S.L., Read T.A., Kessler J.D., Bourboulas M., Schuller U., Machold R.,

Fishell G., Rowitch D.H., Wain
wright B.J., Wechsler
-
Reya R.J.

Medulloblastoma can be initiated by
deletion of Patched in lineage
-
restricted progenitors or stem cells.
Cancer Cell
, 2008, vol. 14, no.
2,
pp. 135

145. doi: 10.1016/j.ccr.2008.07.003.

3.

Packer R.J., Zhou T., Holmes E., Vez
ina G., Gajjar A.

Survival and secondary tumors in children
with medulloblastoma receiving radiotherapy and adjuvant chemotherapy: Results of Children’s
Oncology Group trial A9961.
Neuro Oncol.
, 2013, vol. 15, no. 1, pp. 97

103. doi:
10.1093/neuonc/nos267.

4.

Roussel M.F., Robinson G.

Medulloblastoma: Advances and challenges.
F1000 Biol. Rep.
, 2011,
vol. 3, no. 5, pp. 1

3. doi: 10.3410/B3
-
5.

5.

T
aylor M.D., Northcott P.A., Korshunov A., Remke M., Cho Y.J., Clifford S.C., Eberhart

C.G.,
Parsons D.W., Rutkows
ki S., Gajjar A., Ellison D.W., Lichter P., Gilbertson

R.J., Pomeroy S.L.,
Kool M., Pfister S.M.

Molecular subgroups of medulloblastoma: The current consensus.
Acta
Neuropathol.
, 2012, vol. 123, no. 4, pp. 465

472. doi: 10.1007/s00401
-
011
-
0922
-
z.

6.

Gajjar

A.J., Robinson G.W. Medulloblastoma
-
translating discoveries from the bench to the

bedside.
Nat. Rev. Clin. Oncol.
, 2014, vol. 11, no. 12, pp. 714

722. doi: 10.1038/nrclinonc.2014.181.

7.

Marti E., Bovolenta P. Sonic hedgehog in CNS development: One signal
, multiple outputs.
Trends
Neurosci.
, 2002, vol. 25, no. 2, pp. 89

96.

8.

Hui C.C., Angers S. Gli proteins in development and disease.
Annu. Rev. Cell Dev. Biol.
, 2011,
vol.

27, pp. 513

537. doi: 10.1146/annurev
-
cellbio
-
092910
-
154048.

9.

Fuse N., Maiti T.,

Wang B., Porter J.A., Hall T.M., Leahy D.J., Beachy P.A.

Sonic hedgehog
protein signals not as a hydrolytic enzyme but as an apparent ligand for patched.
Proc. Natl. Acad.
Sci. U. S. A.
, 1999, vol. 96, no. 20, pp. 10992

1099
9.

10.

Ruiz i Altaba A., Sanche
z P., Dahmane N.

Gli and hedgehog in cancer: tumours, embryos and stem
cells.
Nat. Rev. Cancer
, 2002, vol. 2, no. 5, pp. 361

372.

doi: 10.1038/nrc796.

11.

Orth M., Bellosta S. Cholesterol: Its regulation and role in central nervous system disorders.
Choles
terol
, 2012, vol. 2012, art. 292598, pp. 1

19. doi: 10.1155/2012/292598.

12.

Riobo N.A. Cholesterol and its derivatives in Sonic Hedgehog signaling and cancer.
Curr. Opin.
Pharmacol.
, 2012, vol. 12, no. 6, pp. 736

741.

doi: 10.1016/j.coph.2012.07.002.

13.

Ryan K.E., Chiang C. Hedgehog secretion and signal transduction in vertebrates.
J. Biol. Chem.
,
2012, vol. 287, no. 22, pp. 17905

17913.

doi: 10.1074/jbc.R112.356006.

14.

Byrne E.F.X., Sircar R., Miller P.S., Hedger G., Luchetti G., Nachtergaele S., Tully
M.D.,
Mydock
-
McGrane L., Covey D.F., Rambo R.P., Sansom M.S.P, Newstead S., Rohatgi R., Siebold
C.

Structural basis of Smoothened regulation by its extracellular domains.
Nature
, 2016, vol. 535,
no. 7613, pp. 517

522. doi: 10.1038/nature18934.

15.

Huang P.
, Nedelcu D., Watanabe M., Jao C., Kim Y., Liu J., Salic A.

Cellular cholesterol directly
activates Smoothened in Hedgehog signaling.
Cell
, 2016, vol. 166, no. 5, pp. 1176

1187. doi:
10.1016/j.cell.2016.08.003.

16.

Luchetti G., Sircar R., Kong J.H., Nachte
rgaele S., Sagner A., Byrne E.F., Covey D.F., Siebold C.,
Rohatgi R.

Cholesterol activates the G
-
protein coupled receptor Smoothened to promote Hedgehog
signaling.
eLife
, 2016, vol. 5, art. e20304, pp.
1

22
. doi: 10.7554/eLife.20304.

17.

Zhang J., Liu Q.

C
holesterol metabolism and homeostasis in the brain.
Protein Cell
, 2015, vol. 6,
no. 4, pp. 254

264. doi: 10.1007/s13238
-
014
-
0131
-
3.

АТОРВАСТАТИН БЛОКИРУЕТ РОСТ МЕДУЛЛОБЛАСТОМЫ…


563

18.

Dietschy J.M., Turley S.D.

Cholesterol metabolism in the brain.
Curr. Opin. Lipidol.
, 2001, vol. 12
,
no. 2, pp. 105

112.

19.

Goldstein J.L., Brown M.S.

Regulation of the mevalonate pathway.
Nature
, 1990, vol. 343,
no.

6257, pp. 425

4
30. doi: 10.1038/343425a0.

20.

Collins R., Reith C., Emberson J., Armitage J., Baigent C., Blackwell L., Blumenthal R., Danesh J.,
Smith G.D.,
DeMets D., Evans S., Law M., MacMahon S., Martin S., Neal B., Poulter N., Preiss D.,

Ridker P., Roberts I., Rodgers A., Sandercock P., Schulz K., Sever

P., Simes J., Smeeth L., Wald

N.,
Yusuf S., Peto R.

Interpretation of the evidence for the efficacy and
safety of statin therapy.
Lancet
,
2016, vol. 388, no. 10059, pp. 2532

2561. doi: 10.1016/S0140
-
6736(16)31357
-
5.

21.

Dimitroulakos J., Ye L.Y., Benzaquen M., Moore M.J., Kamel
-
Reid S., Freedman M.H., Yeger H.,
Penn L.Z.

Differential sensitivity of various p
ediatric cancers and squamous cell carcinomas
to

lovastatin
-
induced apoptosis: Therapeutic implications.
Clin. Cancer Res.
, 2001, vol. 7, no. 1,
pp.

158

1
67.

22.

Macaulay R.J., Wang W., Dimitroulakos J., Becker L.E., Yeger H.

Lovastatin
-
induced apoptosis o
f
human medulloblastoma cell lines in vitro.
J. Neurooncol.
, 1999, vol. 42, no. 1, pp. 1

11.

23.

Wang W., Macaulay R.J.

Mevalonate prevents lovastatin
-
induced apoptosis in medulloblastoma
cell lines.
Can. J. Neurol. Sci.
, 1999, vol. 26, no. 4, pp. 305

3
10.

24.

Sasai K., Romer J.T., Lee Y., Finkelstein D., Fuller C., McKinnon P.J., Curran T.

Shh pathway
activity is down
-
regulated in cultured medulloblastoma cells: Implications for preclinical studies.
Cancer Res.
, 2006, vol. 66, no. 8, pp. 4215

42
22. doi: 10
.1158/0008
-
5472.CAN
-
05
-
4505.

25.

Gage G.J., Kipke D.R., Shain W. Whole animal perfusion fixation for rodents
.
J. Visualized Exp
.
,
2012, vol.65, art. e3564, pp. 1

9. doi: 10.3791/3564.

26.

Porter

A.G., Janicke

R.U. Emerging roles of caspase
-
3 in apoptosis.
Cell Death Differ.
, 1999, vol. 6,

no. 2, pp. 99

104.

doi: 10.1038/sj.cdd.4400476.




Для цитирования
:

Гордон

Р.Э., Абрамова

З.И.

Аторвастатин блокирует рост медулло
б-
ластомы типа

Sonic

Hedgehog

путем апоптоза

// Учен. зап.
Казан. ун
-
та. Сер. Естеств.
науки.



2017.


Т. 159, кн.

4.


С.
550

563
.






For citation
:

Gordon

R.E., Abramova

Z.I. Atorvastatin blocks Sonic Hedgehog medullobla
s-
toma progression through apoptosis
.
Uchenye Zapiski Kazanskogo Universiteta
. Seriya
Estestve
n
ny
e Nauki
, 2017, vol.

159, n
o.

4, pp.

550

563
. (In

Russian)






Приложенные файлы

  • pdf 42073950
    Размер файла: 762 kB Загрузок: 0

Добавить комментарий